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1 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS POR KJELDAHL
1.1 Objetivos
- Determinar proteínas em alimentos usando o método
de Kjeldahl.
Análise de Nitrogênio Total
• É a determinação mais utilizada;
• Considera que as proteínas têm 16% de nitrogênio em
média (vai depender do tipo de proteína);
100 gramas de proteína------- 16 gramas de Nitrogênio
X -------- 1 grama de Nitrogênio
X = F = 100/16 = 6,25 (fator médio)
16 X = 100
X = 100/16 = 6,25 ( F), Fator de conversão de Nitrogênio
total para proteína total.
Proteína : C, O H, S, N (N é em média 16% em massa
da proteína)
• Fator geral na transformação de nitrogênio para proteína
é de 6,25. Este fator de conversão gera erros quando o
conteúdo em N de um alimento é muito diferente de 16%.
Nestes casos, existem os fatores de conversão
específicos para cada alimento
O fator proteína a ser utilizado pode ser específico para
cada tipo de amostra:
Fator geral 6,25
Gelatina 5,55
Ovos 6,68
Produtos lácteos 6,38
Soja 6,00
Farinha de trigo 5,70
Arroz 5,95
Carnes 6,25
1.2 Introdução Princípio do método
O método de Kjeldahl determina N total em uma
amostra. O método é dividido em três etapas: digestão,
destilação e titulação.
1ª- Digestão: uma quantidade de amostra é oxidada
com ácido sulfúrico e catalisadores a quente. No processo
de oxidação, o N presente na amostra é convertido em
sais de amônio, que permanecem no digerido. Durante a
digestão há liberação de gases como o dióxido de enxofre
e dióxido de carbono.
Reações envolvidas no método:
AMOSTRA → (NH4)2SO4 + CO2↑ + SO2↑ + SO3↑
Mistura digestora + H2O
Na2SO4/CuSO4 : Aumenta o Ponto de Ebulição do
H2SO4 (de 337 para mais de 400)
Amostra início da
digestão
(NH 4)2SO4
Mistura digestora composta de:
Ácido sulfúrico concentrado
Catalisadores (Cu++, Se e H2O2)
K2SO4 ou Na2SO4/CuSO4
2ª- Destilação: inicialmente os sais de amônio são
alcalinizados pela adição de hidróxido de sódio (50%),
resultando na formação de amônia (volátil). Pela
destilação, por arraste de vapor, a amônia é recolhida em
solução de ácido bórico adicionada de indicador de pH.
Nesse ponto, forma-se o borato de amônia, responsável
pela mudança de cor do indicador presente.
Destilação:
(NH 4)2SO4 + 2NaOH ⎯ ⎯ →Na2SO4 + 2NH4OH
2NH4OH ∆ → 2NH3 + 2H2O
2NH3 + H3BO3 ⎯ ⎯ → NH4H2BO3
Ácido bórico com
indicador Tashiro
(meio ácido Tashiro
fica roxo)
NH4H2BO3
Meio básico, Tashiro fica
verde
3ª- Titulação: o borato de amônio é titulado por uma
solução diluída de ácido clorídrico, até nova mudança de
cor do indicador de pH.
A quantidade de ácido gasta na titulação corresponde
ao teor de amônia, que por sua vez representa o teor de
nitrogênio da amostra. A partir do teor de nitrogênio
calcula-se a porcentagem de proteínas totais da amostra,
empregando-se o fator proteína para o material analisado.
A premissa fundamental do método é que todo
nitrogênio presente provém de proteínas. Na maioria das
vezes isto não é verdade devido a presença de outros
compostos nitrogenados como ácidos nucléicos,
aminoácidos não protéicos, culminando no erro do
método.
Titulação:
NH4H2BO3 + HCl ⎯ ⎯ → H3BO3 + NH4Cl
O ácido bórico é incolor, adicionando-se o indicador
vermelho de metila com azul de metileno (indicador
misto de Tashiro), este passa a ter uma coloração
rósea/roxo, a qual virará para verde durante a
destilação e voltará a rosa na titulação.
Pode-se observar que o teor de N na amostra é
proporcional à quantidade de ácido clorídrico gasta na
titulação.
O fator proteína a ser utilizado pode ser específico
para cada tipo de amostra:
Fator geral 6,25
Gelatina 5,55
Ovos 6,68
Produtos lácteos 6,38
Soja 6,00
Farinha de trigo 5,70
Arroz 5,95
Carnes 6,25
1.3 Material e Reagentes
- Leite em pó
- Erlenmeyer de 200 mL
-Microbureta
- Proveta de 50 mL
- Ácido bórico 4%
- Indicador misto de Tashiro
-HCl 0,1 mol/L padronizada
-Mistura digestora
- Bloco digestor
-Destilador de Nitrogênio
- Ácido bórico 4% com (indicador misto de Tashiro)
Mistura digestora: Sulfato de potássio (K2SO4) p.a.,
sulfato de sódio anidro (Na2SO4) ou (CuSO4.5H2O) p.a.;
Catalisador selênio
-H2SO4 concentrado
-10 gramas de (CuSO4.5H2O) + 10 gramas de selênio
para 1 litro de H2SO4 concentrado (preparar 24 horas
antes do uso)
-NaOH 50% (preparar em banho de gelo) exotérmica.
- Ácido bórico 4% com (indicador misto de Tashiro)
Obs: o ácido bórico 4% é incolor, adicionando-se o indicador
vermelho de metila com azul de metileno (indicador misto
de Tashiro), este passa a ter uma coloração rósea/roxo
(meio ácido), a qual virará para verde durante a
destilação e voltará a rosa na titulação (com HCl 0,1
mol/L).
-Tubo de digestão
- Indicador misto de Tashiro: pesar 200 mg de vermelho
de metila e 100 mg de azul de metileno em um béquer de
200 mL. Dissolver os indicadores em 80 mL de etanol p.a.,
filtrar para um balão volumétrico de 100 mL, utilizando
papel de filtro. Após filtragem completar o volume do
balão para 100 mL
1.4 Parte Experimental
Digestão:
Pesar em balança analítica entre 0,25 e 0,5 g de amostra
e transferir para tubo de Kjeldahl. Adicionar 10 mL de
mistura digestora. Aquecer em bloco digestor, a princípio,
lentamente, mantendo a temperatura de 50ºC por 1 (uma)
hora. Em seguida, elevar gradativamente até atingir
350ºC. Quando o líquido se tornar límpido e transparente,
de tonalidade azul/esverdeada, retirar do aquecimento.
Se necessário adicionar 1 mL de H2O2 (peróxido de
hidrogênio)
Deixar esfriar e adicionar 10 mL de água antes da
destilação.
AMOSTRA → (NH4)2SO4 + CO2↑ + SO2↑ + SO3 ↑ + H2O
Produto da digestão: (NH4)2SO4
Sulfato de Amônio
Destilação:
Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo 25
mL de solução de ácido bórico a 4 % com solução de
indicador misto de Tashiro (erlenmeyer receptor do
destilado).
Ácido bórico com
indicador Tashiro
(meio ácido Tashiro
fica roxo)
NH4H2BO3
Meio básico, Tashiro fica
verde
NaOH 50%→
Erlenmeyer de coleta de
NH3
Tubo com amostra
digerida
Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar
a solução de hidróxido de sódio a 50 % até que a
mesma se torne negra (tubo verde de amostra
digerida) (cerca de 25mL). Proceder a destilação
coletando cerca de 150 mL do destilado (o destilado
ficará verde) . A solução receptora deve ser mantida
fria durante a destilação.
(NH4)2SO4 + 2NaOH ⎯ ⎯ → Na2SO4 + 2NH3 + H2O
2NH3 + H3BO3 ⎯ ⎯ → NH4H2BO3
Rosa/roxo Verde
Produto da destilação: NH4H2BO3
Borato de Amônia (Verde)
Titulação:
Titular com solução de ácido clorídrico 0,1 mol/L até a
viragem do indicador.
NH4H2BO3 + HCl ⎯ ⎯ → H3BO3 + NH4Cl
Verde titulante Rosa/roxo
NH4H2BO3
Meio básico
Tashiro fica verde
H3BO3 + NH4Cl
Ácido bórico com
indicador Tashiro
(meio ácido Tashiro
fica roxo)
Anotar volume de HCl gasto na titulação da amostra e do
branco.
1.5 Resultado
Usando a massa molar do nitrogênio, a concentração
e volume gasto do ácido clorídrico, o fator proteína e o
peso da amostra, determinar a porcentagem de proteína
na amostra. Comparar o resultado encontrado com o
resultado da legislação e o valor rotulado, quando
aplicáveis.
Exemplo:
Massa de amostra de alimento = 0,4523 gramas
(452,3 mg)
VHCl amostra = 15,3 mL
VHCl branco= 0,3 mL
HCl = 0,1 mol/L, f = 1,03
Cálculos:
massa de N total = (Va - Vb)HCl x conc.HCl x f (HCl) x 14
14 = (massa do nitrogênio)
m N total = (15,3 - 0,3) x 0,1 x 1,03 x 14 = 21,0 mg
m de proteína = m N total x 6,25 = 131,25 mg
Massa de amostra = 452,3 mg
135,19 mg de proteína ------ 452,3 mg de amostra %
proteína -------- 100 mg de amostra
% de proteína = 29,01%
1 Eq HCl _____________ 1 Eq Nitrogênio
1N (1Eq/1000 mL) _____ 14 g Nitrogênio
1N (1mL) ____________ 0,014g Nitrogênio
0,1N (1mL) ___________ 0,0014g Nitrogênio
Logo: 1mL (0,1N) __________ 0,0014g Nitrogênio
Vol. de HCl __________ Xg Nitrogênio
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